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那些年，被荧光定量PCR虐过的实验汪

点击次数：  更新时间：2017/11/11 14:52:44  

想做荧光定量PCR技术达人？连思想者思考了这么多年都还在思考，想玩转荧光定量PCR可没那么容易！

实时荧光定量PCR实验操作注意事项 

① 应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。

② 要严格防止气溶胶交叉污染。采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。

③ 实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。

④ 荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。

⑤ 在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。

⑥ 所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。

⑦ 不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。

实时荧光定量PCR的常见问题及解答

1、Sybr Green、Taqman方法如何选择？

2、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案：

① 实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。

② 通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。

③ 荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。

④ 引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。

⑤ 模板量不足，增大模板的加入量。

⑥ 模板降解，尤其模板是RNA时很容易由于模板的降解而产生假阴性结果；通过缩短样本提取和加样时间，加入RNA酶抑制剂等方法进行改进。

⑦ 加入样品中存在PCR抑制物。

⑧ PCR仪器故障，找仪器工程师排除。

⑨ 样本中不存在对应模板或样本选择错误。

3、实验中出现假阳性及其解决方案：

① 实验室气溶胶污染，严格按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》进行实验室建设，在实验操作过程中严防汽溶胶的产生。

② 标本交叉污染，通过规范实验操作防止。

③ 移液器使用引起的交叉污染，通过使用带滤芯吸头和规范移液器使用方法来防止。

④ 引物探针设计的特异性不够引起，要求厂家重新研发产品。 ⑤ 反应体系中Mg2+浓度过高，要求厂家重新研发产品。

4、内标法和外标法哪种数据更精密？

是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

5、为什么终点定量不准确？  

我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。

传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。  

对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。