PCR技术研究 您的位置：首页 > 实验方法 PCR技术研究

原位PCR实验老出错，听听老司机怎么说？

点击次数：  更新时间：2017/11/17 16:34:51  

标本的制备

原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好，石蜡切片效果最差。

注意：要防上细胞、组织标本在原位PCR操作过程中脱落。

①承载标本的载玻片要涂以多聚赖氨酸或进行硅烷处理；

②多聚赖氨酸用消毒蒸馏水配置，使浓度为lmg／ml；

③分装后-20℃冰箱保存。

④涂片时先在载玻片的涂面用铅笔或钻石笔做上标记，再将一小滴PLL溶液（约5μl）滴在玻片上，用另一玻片的边缘象制备血涂片那样将PLL均匀地在玻片上涂上一薄层。

⑤1-2 min后，PLL薄层即干燥，玻片收藏备用。

组织细胞的固定

步骤：以10%的缓冲福尔马林或4%的多聚甲醛固定后进行原位PCR；

固定的时间：一般不宜过长，视组织的大小，一般以4℃4-6小时为宜。 

预处理制备好的组织标本

原理：经蛋白酶消化的组织细胞，可增加其通透性，充分允许反应体系中的各成分进入细胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于扩增。

常用的蛋白酶有：蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。

注意事项：蛋白酶消化后，要加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除，因为只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的PCR反应体系的数量TaqDNA酶产生毁灭性的影响。 

原位扩增

原位扩增也即在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理及反应条件与液相PCR相同，但由于PCR是在固定的细胞组织标本上进行，所以也有其特殊性。

1、引物：PCR所用的引物一般为15-30bp为宜，扩增的片断为100-1000bp左右。原位PCR宜用较短的引物。在原位PCR组织标本制备过程中，DNA和RNA常有一定程度的降解。尤其是存档组织的石蜡切片，DNA和RNA的降解就更明显。从蜡块组织中提取的DNA，很少超过400bp，RNA 则不超过200个碱基。

2、反应体系：原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同，由于是在经过固定的组织切片上进行，为获得较好的扩增效果，有人主张反应体系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的浓度均应高于液相的PCR反应体系。在反应体系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。 

3、热循环：原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行，操作简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。 

后处理

原位扩增结束后，标本应清洗，以除去弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分，会导致扩增产物在检测时显现，造成背景过深或假阳性结果的出现。但是，洗涤过度，也会造成细胞内扩增的产物被洗脱，是阳性信号减弱或丢失。 

有的研究者在标本原位扩增后，用多聚甲醛（4％，2h）或戊二醛（2％，5 min）进行后固定，以使扩增产物在随后的检测过程中能保留在细胞内，提高检测的敏感性和特异性。要注意的是后固定应适度，过强的后固定会影响原位杂交检测时探针与特异性扩增产物的结合。

原位检测

原位PCR的扩增产物检测方法，取决于原位PCR的设计方案，直接法则根据标记分子的性质对扩增产物直接进行原位检测。间接法则需用原位杂交的方法进行检测。