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免疫沉淀步骤

点击次数：  更新时间：2017/8/14 13:58:24  

材料

1. 蛋白A 或蛋白G

2.一抗

3.免疫沉淀缓冲液：20 mM 磷酸钠, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠.

（> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠 也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）

4.洗脱液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5

5.SDS-PAGE 上样缓冲液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 碱, 10% 甘油, 2-5% 2-巯基乙醇,

步骤：

1.用50 μl免疫沉淀缓冲液溶解抗原，向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下，在此体积下2-5μg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。

2.样品4°C.孵育过夜。

3.将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中(~ 50 μl of gel per 5 μg of antibody)。

4. 室温下，轻柔混匀样品，孵育2小时。

用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物，离心2-3分钟，弃上清。重复此步骤至少6次。

5.用50 μl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟，将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来，离心，收集上清。另用50 μl洗脱液孵育胶5分钟，离心，收上清。将两个上清混合。

6. 立即调节蛋白样品的pH至生理值，用一种合适的、多次离心的缓冲液调节，如1.0 M Tris, pH 7.5 (10 μl of this buffer to 100 μl of the supernatant should be sufficient).

7.将洗脱成分除盐。

8.准备好样品待定性。

NOTE：如果用SDS-PAGE定性蛋白质，省去步骤6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟，弃上清。用25μl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心，收集上清。重复一次，汇集上清至总体积50μl。由此样品则准备妥当。