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想要获得高质量荧光western blotting，需注意六大点

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:26:48  

Western blotting是蛋白质研究中最经典最常用的技术之一。荧光western blotting因为它的三大特点【高检测灵敏度、宽线动态的范围、还有多通道检测的特点】现在已经受到了很多科研工作者的喜欢了。

那我们要如何在同一张膜上实现多通道检测呢，这个的话可以使用不同荧光标记的二抗，这样就能避免了stripping和reprobing，可实现泳道内参蛋白归一化和总蛋白归一化，使蛋白质定量检测更准确。

怎样获得高质量的荧光western blotting结果呢？下面中洪博元就将降龙神功倾囊相授传。

一、避免荧光污染

1.因为记号笔、圆珠笔有荧光信号，容易被洗脱，染到整个膜上，所以我们可以用铅笔代替圆珠笔标记膜避免产生干扰信号。

2.切记不用使用曾经用过考马斯亮蓝染色的盘子进行孵育，一定要保证镊子还有容器的整洁干净。

3.因为溴酚蓝是会产生荧光信号的，所以我们为了确保跑胶时没有溴酚蓝残留，或在转印前切掉凝胶上的溴酚蓝部分需要接触膜时，可使用无粉手套。

二、膜

我们可以选择低荧光背景的NC或PVDF膜，因为这种膜容易获得高信噪比图像。可用一小张新膜在激光成像仪上进行成像，观察其荧光信号强弱，选择其中背景低的进行实验。

三、封闭

为了避免交叉信号干扰，我们可以选择不同种属来源的一抗，（比如选择mouse和rabbit，避免同时使用mouse或rat抗体）

还有进行多通道实验前，预先对每种蛋白单独摸索优化抗体浓度，从化学发光转到荧光检测时，可适当增加一抗浓度

四、二抗

选择与成像仪激发光匹配的荧光标记二抗，并且避免信号交叉干扰（尽量选择发射光波长距离远的染料）

二抗小量分装，避光保存，使用前离心，取上清稀释，进行实验

可优化二抗稀释度，以获得更高的信噪比，可使用1:2000-1:5000稀释

二抗避光孵育

吐温能产生荧光干扰，二抗洗涤以后，需要用不含吐温的洗涤液（PBS/TBS）将膜上的吐温洗净

使用Cy5 来检测低丰度的蛋白

五、检测三种蛋白–triplex

使用三种不同种属来源的一抗（比如选择mouse、rabbit和goat）

当不同种属来源抗体的获得出现困难时：可直接使用荧光（推荐Cy5）标记的一抗，一般用于检测高丰度蛋白。也可选择染料自行进行一抗标记。

六、成像

激光成像它的优势是激光光源单色性好，能量高，可获得更高的荧光检测灵敏度。

扫描成像它的优势是逐点扫描模式保证整个样品上的每个位置都接收到完全一致的激发光能量，使得定量更准确。