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体外DNA重组技术--载体与DNA片段的连接反应

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:52:03  

载体与DNA片段的连接反应

【实验目的】

学习和掌握DNA连接酶的使用原则和基本方法

【实验原理】

DNA连接酶可以在两个双链DNA分子相邻的5'-磷酸与3'-羟基之间形成磷酸二酯键，从而可以实现重组DNA分子的构建。一般在连接反应之前，DNA分子都要进行限制性内切酶消化，使待重组的DNA分子具有相匹配的末端，黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的，但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。

下面以质粒DNA为载体，介绍目的DNA片段与载体的连接。

黏性末端的连接涉及三种情况：①载体和DNA片段经双酶切后，两端具有不同的粘端，可以直接进行连接反应。②载体和DNA片段单酶切后，在DNA片段两端是互补的粘端。DNA片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在DNA5'-端去磷酸化，否则线性载体DNA分子将发生自身环化连接。

（一）5'-端去磷酸化反应

通常只对载体DNA分子进行5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。

【实验试剂与器材】

1. 小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)

2. 10×CIP缓冲液

【实验方法与步骤】

1. 酶切DNA反应，在75℃加热15min灭活酶活性；

2. 10×CIP缓冲液和1U CIP，混合后，37℃孵育30～60min，然后75℃加热15min灭活CIP活性；

3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的DNA片段用于连接反应。

（二）连接反应

【实验试剂与器材】

1. T4 DNA连接酶

2. 10×T4连接酶缓冲液

【实验方法与步骤】

反应体系：

质粒DNA (0.5(g/?滋l)            

      

DNA插入片段(300ng/?滋l)     

      

10× 连接缓冲液             

      

T4 DNA连接酶           

      

加水至总体积          

      

混合后置14～16℃水浴6～12h。

【注意事项】

1）通常DNA插入片段与载体DNA的摩尔比为3:1或2:1，需根据DNA分子量计算，而不取决于浓度；2）平齐末端连接时，插入片段的量要远远大于载体DNA的量，可以为5:1或更多，即使这样，连接效率仍然很低。3）有时DNA一端是粘端，另一端是平端，这种连接与双酶切粘端连接相似；4）不匹配末端需要连接时，首先要将末端处理成平端，然后再进行连接反应。