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常用的免疫酶染色方法

点击次数：  更新时间：2017/8/14 20:59:20  

常用的免疫酶染色方法

分为以下两种方法：

（一）酶标抗体法

*直接法

*间接法

（二）非标记抗体酶法

*酶桥法

*PAP法

（一）酶标抗体法

*通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。

-优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。

-缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。

(1) 酶标抗体法——直接法

将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。

(2) 酶标抗体法——间接法

*将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

(a) 酶标抗体间接法的操作步骤

*标本准备：

-石蜡脱蜡至水；

-冰冻切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；

-细胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；

*石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；

*封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min (湿盒内) ；

*0.01M PBST漂洗，5min×3；

*5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30min (湿盒内) ；

*倾去血清勿洗，加1％BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37°C孵育60min 或4°C过夜(湿盒内)；

*0.01M PBST 漂洗，5min×3；

*加HRP 标记的二抗室温孵育lh或37°C 30min ；

*加0.01％H2O2~0.05％DAB显色 (显色液应新鲜配置)；

*经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。

（二）非标记抗体酶法

酶桥法

*首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；

*以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；

*再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布

-优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。

几点说明

*一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。

*二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。

*因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。

PAP法

* 与酶桥法相似，不同的是，PAP 法将酶桥法的第 3、4 步并为1步，用PAP复合物代替。

*PAP是离体制备的复合物( HRP--抗 HRP)。

*显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。

PAP法评价

*PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。

-缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。

*由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。

(二) 亲和组织化学法

*是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。

*这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。