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细胞生长曲线的测定

点击次数：  更新时间：2017/8/15 12:12:57  

实验背景

    

生长曲线是细胞数量随培养时间而变化的曲线。可分为几个阶段：

    

潜伏期：即细胞对传代操作所致损伤的恢复期或对新生长环境的适应期。细胞修复自身损伤，熟悉新环境，恢复生长。原代培养细胞潜伏期较长，一般24-96h或更长。连续培养细胞系潜伏期短，一般6-24h。

    

指数生长期，或称对数生长期：是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞呈指数生长。指数生长期内细胞增值活动的程度可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。常以有丝分裂指数（MI）、细胞群体倍增时间来表示。指数生长期时细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验的主要阶段。

    

停滞期也指平台期：细胞经过指数生长期后达到较高的密度，培养基中的养分也消耗较大，培养液中代谢废物积聚较多，细胞不再分裂增殖，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞。但细胞人存在代谢活动，此时，若要使细胞恢复生长，应该立即传代。

实验原理

生长曲线的测定是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可以可以使用MTT比色法。其原理是：MTT被活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲瓒（Formazan），甲瓒被助溶剂溶解后，可在酶标仪上于570nm处读取OD值，在一定范围内OD值与活细胞数量呈线性关系。因此，OD值可间接地反应活细胞的状态。接种培养细胞后每天定时去除细胞，惊喜MTT检测，可以得到细胞生长曲线。用MTT发可以检测某些药物作用下细胞生长活力的变化，静儿评价药物对细胞存货和生长的作用。测定细胞生长的另一个指标是有丝分裂指数，为计数1000个细胞中分裂细胞数，可以检测细胞增殖旺盛的程度。

细胞生长曲线的绘制（MTT法）

1 无菌培养实验室准备（同细胞传代培养），从CO2培养箱中去除细胞，弃去培养液，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，弃去胰蛋白酶液，使用新的含10%小牛血清的培养基制成细胞悬液后计数。

2 按照4×103细胞/孔接种于96孔板，0.2ml培养基/孔（如果是悬浮细胞，则0.1ml培养基/孔），做传代培养。设置3个空白对照孔，只加无细胞的培养基。

3 24h后加入待检药品，可加入几种不同浓度的待检药品。对照组不加药，24h时选取其中3个孔更换新鲜培养基100ul，加入0.01ml的MTT（5mg/ml）放回37℃孵育4h，之后加入100ul的裂解液，37℃过夜。

5 5天后统一在酶标仪上于570nm下检测，得出OD值（或者加入裂解液后过夜每天检测）。以空白对照调节零点。

注意事项：

1 接种细胞要准确，接种时要充分使细胞混匀，防止细胞沉淀造成细胞接种不均。

2 MTT溶液见光后颜色会逐渐变深，因此在加入裂解液后96孔培养板应避光孵育/处理。

3 可以在全部MTT实验做完后一起上机检测OD值，但前提是前面已经做完了的须避光处理。也可采取加入裂解液后每天检测一次OD值，但使用的酶标仪应该性能稳定，隔天检测结果应一致。