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单细胞电泳技术(一)

点击次数：  更新时间：2017/9/28 10:53:06  

1、预先培养材料细胞，并处理准备实验用在载玻片，盖玻片。

    

2、是眼前配置0.2%的常熔点琼脂糖凝胶，将溶液放入60摄氏度水浴中，每个载玻片放入溶液中3S，然后取出。将此载玻片水平放进37摄氏度温箱中，大于4h，即可使用。

    

3、取处于对数期，生长良好的MCF-7细胞，至于不同剂量的UV下照射一段时间，若想观察细胞的DNA损伤修复情况，还可将部分细胞在培养箱中培养一段时间。可设置不同时间梯度来做对照实验。

    

4、细胞消化后，离心富集，并用PBS液洗涤2-3次，清洗过程中要注意细胞要置于冰盒中，以抑制DNA损伤修复系统的持续作用，吹打细胞悬液不要过于激烈，以免细胞进一步受到机械损伤。最后用PBS液将其密度调整为1*106-2*106个细胞/m.l

5、制片：在载玻片两端用搭桥法放置盖片，两搭桥盖片间宽度为1cm，将细胞悬液与配置好的1%的低熔点琼脂糖（LMP）以1:1的比例在小离心管内混匀；在桥面盖片和载玻片间灌入约100ul细胞与胶的混合液，置于4℃。

6、胶凝固20min后，小心从载玻片一侧抽取下各张搭桥盖片，抽取过程中注意保持胶面平整。

7、裂解：将载玻片移入裂解槽，注入裂解液，浸没玻片，4℃避光裂解1.5-2h。

8、水洗：将载玻片移入新的裂解槽，注入三蒸水浸没玻片，4摄氏度水洗3次，每次5min。

9、解旋：将载玻片移入新的裂解槽，注入电泳缓冲液，浸没玻片，4摄氏度解旋20min。

10、电泳：将载片移入电泳槽，调节电泳槽两端电压为20V，200mA，4摄氏度，电泳20min。

11、中和：将载玻片移入新的裂解槽，注入中和液，浸没玻片，4摄氏度中和三次，每次5min.

12、梯度脱水：将载玻片移入新的裂解槽，进行梯度乙醇脱水（80%、100%），每个梯度脱水5min。

13、待载玻片室温干燥后，每片滴加PI（20ug/ml）20ul，再覆盖盖玻片，避光染色20min，注意盖片下不要产生气泡。

14、荧光显微镜下观察、采图，每份样品随机拍摄50个DNA受损细胞图像，还可用CASP彗星专用数据分析软件进行数据分析。