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老司机带你一文打尽细胞的冻存与复苏！

点击次数：  更新时间：2018/1/4 10:59:13  

般来说，细胞进行转移，最佳的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻快融，这样科研最大限度的保存细胞活力。

一、材料准备

1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。

3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1~2ml）。

4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5.PBS,胎牛血清，DMSO，培养液，双抗，胰蛋白酶（0.25%）

二、细胞冻存

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

3、离心1000 rpm,5 min.

4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml.

5、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

三、细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2、从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

3、离心，1000 rpm，5 min。

4、弃去上层清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

5、次日更换一次培养液，继续培养。

四、注意要点

1、冷冻越慢越好，复苏越快越好

2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。

3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。

5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。

6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。