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腺病毒操作手册完整版，值得收藏

点击次数：  更新时间：2018/1/8 15:51:58  

            

（腺病毒转染后的细胞照片）

1.腺病毒安全使用和注意事项

1）腺病毒相关实验请务必在生物安全柜内操作；

2）腺病毒相关实验请穿实验服，佩戴口罩和手套，请尽量不要有裸露的皮肤；

3）操作腺病毒时需要特别小心，防止病毒溅出。如果操作时生物安全柜内有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干净。

4）腺病毒相关实验接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶等请用84 消毒液浸泡后，再进行统一处理。

5）腺病毒相关实验的废弃物需要收集，再统一进行高温灭菌后处理。

6）腺病毒相关实验完毕后请用洗手液清洗双手。

2.腺病毒储存与稀释的注意事项

1）腺病毒的储存

收到病毒液后，若在短期内（一周内使用完最佳）使用，请将病毒置于4℃ 保存；如需长期保存请分装后置于-80 ℃ 。

注：反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。

2）腺病毒的稀释

需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS 或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。

3.整体实验流程

4.实验材料

1. 载体信息：

2. 菌株：大肠杆菌Stbl3，用于扩增腺病毒载体。

3. 细胞株：293A细胞，腺病毒包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM完全培养基。

5.腺病毒包装和浓缩

1）质粒的构建和扩增

构建有目的基因的腺病毒质粒需要经过大量抽提，浓度要求大于1ug/ul，A260/280 在1.7~1.8 范围内方可用于病毒包装。推荐使用Sigma大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。

2）质粒的线性化

将含有目的基因的腺病毒质粒用Pac I单酶切使之线性化。采用经典的酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度。

3）腺病毒包装

转染操作按Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染手册进行，具体步骤如下：

1. 第二天转染前移去培养液，每孔换成1.5ml opti-MEM培养液；

2. 配置质粒和脂质体复合物：37℃水浴锅预热 opti-MEM。

3. 转染：将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2的培养箱中培养5-6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；

4）腺病毒收毒

1. 每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变（CPE）出现（一般出现在转染后的7-10天，第11天未出病斑则重新包装）；

2. 让感染继续发生，直至80%CPE 出现（一般出现在转染后的10-13天）。收集细胞及上清液至灭菌的15 ml离心管，-80℃ 保存；

3. 上述细胞及上清液反复冻融3次，使病毒从细胞中释放出来，离心收集上清并0.45um滤膜过滤，获得腺病毒初液分装1ml/管，-80℃ 保存；

5）腺病毒的扩增

1. 病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10 cm培养皿中以3×106细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%，（种板皿数根据腺病毒需求量：常规：1E10病毒颗粒≈10皿）；

2. 感染时在10 cm皿中加入100 ul初级病毒液，轻轻混匀；

3.在37℃，5％的CO2的培养箱中培养，期间观察荧光情况（荧光率90%以上表明初液良好）；至80%～90%的CPE 出现，或者80-90%细胞变圆并漂浮（一般在感染后2-3天）；

4.收集细胞至灭菌的15 ml离心管，收集的细胞置于-80℃，30 min，随后置于37℃ 15 min（不要超过15 min）。反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来，离心并0.45um滤膜过滤，准备病毒纯化或者于-80℃ 保存。

6）病毒纯化

使用BioVision公司的PEG Virus Precipitation Kit，将腺病毒原液纯化并浓缩至约定体积（常规1ml）。一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。

6.定腺病毒滴度

采用TCID50法检测腺病毒滴度，原理是通过梯度稀释病毒液侵染293A细胞中，记录每个梯度中出现CPE的孔数，根据Reed-Muench两氏法，即可确定腺病毒的滴度。

7.感染目的细胞

1. 调节细胞至对数生长状态，病毒侵染前一天接种至细胞培养板，可以选用96孔，48孔，24孔或12孔板进行实验（取决于所购得病毒量多少，及实验者所需细胞量）接种后使第二天细胞密度达到80%左右。设定病毒感染孔和阴性对照孔

2. 细胞换液：根据不同细胞种类及实验设计，可以选择合适培养液，细胞换液后置CO2培养箱培养2小时。

3. 病毒液配置，将病毒液冰上融解后，按设计的MOI值（如MOI=1，2，5，10，30，60，120，250，500，1000…）用培养液稀释，轻轻混匀。

MOI值的计算：MOI值=加入病毒总数/细胞总数，如一个培养孔中细胞数为1×105个，加入1×106ifu的病毒时，侵染实验中MOI为10。

病毒侵染MOI参考值：不同细胞对腺病毒易感性不同，决定了达到最佳的效果（即对细胞存活影响较小，又能使侵染比例高）所需的MOI值不同。一般较易感染细胞只需MOI值1-10（以活性滴度计算），而较难侵染的原代细胞，干细胞，悬浮细胞通常在50-500甚至更高（以活性滴度计算）之间。建议对具体实验细胞进行梯度测定。

4. 培养箱中孵育过夜后，换上新鲜培养基。

5. 病毒感染48-96小时后，阴性对照可以观察到荧光细胞，证明细胞感染成功。

8.动物实验

将纯化过的腺病毒以每只小鼠5×109~1×1010 个病毒颗粒数注射。具体的注射量需要进行实验摸索。