Southern blot实验
点击次数： 更新时间：2018/8/17 10:22:04
实验方法原理：
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA 或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性标记的探针与被固定的模板杂交，经显影或现色后检测出目的DNA 或RNA 分子所处的位置。
实验步骤：
1. 基因组DNA限制性内切酶酶切
（1）设置50 ul 反应体系，在200 ul EP管中加入：
| 10 ug 基因组DNA | x ul |
| 去离子水 | 49-x ul |
| 10×buffer | 5 ul |
| EcoR Ⅰ | 4 ul |
（2）充分混匀，离心20 s。
（3）置于PCR议上37℃反应过夜。
（4）加1/10体积乙酸钠、2体积无水乙醇沉淀DNA晾干。
（5）加20 ul TE buffer溶解DNA。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳
（1）用0.5×TBE buffer配制0.8%琼脂糖凝胶，微波炉加热至溶化，加入EB（0.5 ug/ml）混匀后倒入制胶器中室温凝固。
（2）凝固后，去除样品梳及胶带，置于水平电泳仪中。
（3）将DNA样品用6×DNA landing buffer 混匀后加入样品孔中，恒压电泳（20 V/10 mA）直至染料电泳至边缘。
（4）电泳完毕，取出凝胶切角并在凝胶成像系统成像记录。
3. DNA转移与固定
（1）凝胶置于0.25 M HCl中处理30 min，去离子水洗1次。
（2）碱变性：凝胶置于0.4 M NaOH变性液中作用20 min。
（3）毛细管法转移：根据凝胶大小裁剪与其等大小尼龙膜、滤纸片，尼龙膜一角软铅笔作方位标记。
（4）去离子水浸泡尼龙膜、滤纸片，中再浸泡5 min。
（5）按下图安装转移槽进行转移过夜（0.4 M NaOH转移液）。
（6）转移完毕后取出尼龙膜，2×SSC浸泡5 min，滤纸吸干，夹在2层干净滤纸。
4. 预杂交与杂交
（1）预杂交：将尼龙膜置于预热DIG Easy Hyb工作液（37℃~42℃）中摇晃充分作用30 min。
（2）探针变性：DIG标记探针煮沸5 min 后迅速置于碎冰中，用预热DIG Easy Hyb工作液制备含探针的杂交液。
（3）弃去预杂交液，加入杂交液42℃摇动孵育4小时或过夜。
（4）2×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（5 min×2），不断摇动。
（5）5×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（155 min×2，65~68℃），期间不断摇动。
5. 杂交检测
（1）Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。
（2）100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。
（3）100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
（4）Washing buffer洗膜（15 min×2）。
（5）20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
（6）将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动）。
（7）当出现条带时，TE-buffer洗膜（5 min×1），终止现色。
（8）照相记录，80℃烤干，储存。
（9）扫描计算EGFR基因扩增的倍数。
注意事项：
1. 为了防止缓冲液流从凝胶边缘之外通过，沿凝胶的每一边放置一条 Parafilm膜，使滤纸桥与层叠上部的吸湿材料无法接触。
2. 核酸转移的选择尼龙膜比NC膜好，是目前较理想的核酸固相支持膜。
3. 尼龙膜漂洗尽量彻底，可降低背景。
4. color-substrate solution要新鲜配制。
5. Tm = 49.82 + 0.41 （% G + C） - （600/l） [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25° C（The given numbers of the equation were calculated according to a standard（The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.） The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 20-25° C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismatches between probe and target. When the degree of homology of your probe to template is less than 80%, you should lower Topt. accordingly （approx. 1.4°C below Tm per 1 % mismatch） and alsoadjust the stringent washing steps accordingly （i.e. increase SSC concentration and lower washing temperature）.
本文转载自丁香通
