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应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）

点击次数：  更新时间：2018/8/23 14:06:41  

实验原理：

反转录 PCR ( reversetranscriptase'PCR，RT-PCR ) 是一种从 RNA 扩增 cDNA 拷贝的方法。RT-PCR 对于获得与克隆 mRNA 的5'、3' 末端序列和从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库方面都是极为灵敏与通用的方法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

实验步骤:

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10X 扩增缓冲液

氯仿

4 种 dNTP 的贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

乙醇

MgCl₂ ( 50 mmol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盘 RNase 抑制剂（20 单位/μl )

2. 酶与缓冲液

反转录酶（RNA 依赖的 DNA 聚合酶）

热稳定的 DNA 依赖的 DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核苷酸与寡核苷酸

外源参考 RNA

用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物

oligo ( dT）_12~18 溶于 TE ( 100 μg/ml，pH 8.0)

随机六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml，pH 8.0）

基因特异性寡核苷酸（20 μmol ) 溶于水（终浓度 20 pmol/μl)

正义与反义寡核苷酸引物用于 cDNA 的 PCR 扩增


总 RNA ( 100 μg/ml ) 或带 poly (A) ⁺ RNA ( 10 μg/ml ) 溶于水中

1. 一只盛有 10~100 个细胞的离心管，在 4℃ 下离心 5s，沉淀样品。

2. 吸弃上清液，加 10~20 μl 冰冷裂解液。非常轻微地振荡离心管，使细胞分散于裂解液中。

3. 离心管在冰浴上放置 5 min, 然后在 4℃ 高速离心 2 min，上清液可直接用于 RT-PCR 的模板。

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5 ml, 薄壁扩增反应专用离心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 仪

水浴箱水温设置在 75℃ 和 95℃

二、方法

1. 转移 1 pg~100 ng 的 poly(A) ⁺ RNA 或 10 pg~1 μg 的总 RNA 到一只新的离心管。

用水调整体积至 10 μl；将 RNA 样品在 75℃ 变性 5 min, 将离心管迅速插入冰中冷却。

2. 对含有这种变性的 RNA 样品的离心管内依次加入如下试剂：

10X 扩增缓冲液                                      2 μl

20 mmol/L 4 dNTP 混合液（pH 8.0）      1 μl

引物（最优先的，见下面）                     1 μl

约 20 单位/μl 胎盘 RNase 抑制剂            1 μl

50 mmol/L MgCI₂                                              1 μl

100~200 单位/μl 反转录酶                      1 μl

H₂O 补足至                                           20 μl

温育在 37℃ 反应 60 min。MgCl₂ 为反转录酶作用所必需。

设置 3 支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链 cDNA 反应所需要的所有试剂，但不加模板 RNA；第 2 支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第 3 支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证 cDNA 产物不是由于污染或由 RNA 的自身引导所致。

3. 将反应管在 95℃ 加热 5 min，使反转录酶失活和 RNA-cDNA 杂合物变性。

4. 调整反应混合液体积以便正义和反义引物浓度在 20 pmol/L。

5. 离心管内加入如下反应试剂：

1X 扩增缓冲液（或调整反应体积至 99 μl） 77 μl

1~2 单位热稳定 DNA 聚合酶                      1 μl

6. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl）。如果应用热启动 PCR 程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。

7. 扩增反应有交性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



8. 抽取每种扩增样品 5~10 μl，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭）或 SYBR 金颗粒染色来观察扩增的量与片段大小。

9. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤6)，反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

10. 把扩增产物克隆到已经制备好的相应的载体上。克隆之前，从扩增的 DNA 产物中分离去除残余的热稳定 DNA 聚合酶和 dNTP。然后，DNA 片段可以连接到一种平末端载体或 T 载体，或者用限制性内切核酸酶进行酶切后，再连接到具有相应末端的载体上。

本文转载自丁香通