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外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验

点击次数：  更新时间：2018/9/19 16:35:11  

实验原理：

限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

实验步骤：

1.  载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
50 μl反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）
DNA           30 μl
R.E           1 μl
10×buffer        5 μl
ddH₂O           14 μl

外源片段酶切产物和5 μl 37 ℃反应1hr，分别取8 μl  PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA

2.  加入ddH₂O 150  （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 g离心10 min；

3.  吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20 ℃放置15分钟以上；

4.  12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟；

5.  ddH₂O（1.5 ml ddH₂O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 μl 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10  tube中）；

6.  按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50 ℃反应30 min 以上
DNA                   20 μl
CIAP（TaKaRa）        0.5 μl
buffer              4.0 ′10 μl
ddH₂O               15.5 μl

7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；

8.  按2－5步纯化载体，溶于10 μl ddH₂O；

9.  连接反应
DNA                10 μl
pUC18            2.5 μl
buffer           1.5 ′5 μl
mT4 ligase   3 U/μl

16 ℃水浴过夜

10.  转化大肠杆菌感受态细胞

11.  转化子的鉴定

本文转载自丁香通