病理学 您的位置：首页 > 实验服务 病理学

免疫组织化学反应结果的判断标准

点击次数：  更新时间：2017/3/30 14:19:50  

免疫组织化学技术自开展以来日益受到人们的重视,已被广泛地运用在病理诊断及研究领域。敏感的免疫酶标过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法和亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(ABC)法的出现,使病理工作者能够通过常规福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片或细胞涂片检测各种抗原成分从而识别肿瘤细胞,并为肿瘤的组织来源、分类和诊断提供了科学的客观依据,开辟了人类认识肿瘤和肿瘤病理诊断的新途径。近年来癌基因和抑癌基因日益成为人们研究肿瘤的热门领域,最初采取的是分子生物学方法,癌基因蛋白产物的出现使我们可以通过免疫组织化学这个简便而快速的方法来研究癌基因和抑癌基因,进而研究肿瘤的发生、发展机制,并判断预后,为免疫组织化学的应用开辟了新的领域。

一、判断免疫组织化学反应结果应有一个统一的标准

免疫组织化学工作的开展也遇到一些问题,其中最突出的就是免疫组织化学判断结果上的不一致。我们经常碰到这种情况:读片会上某些作为免疫组织化学阳性片打出的幻灯引起争议。在日常工作中,对同一张免疫组织化学切片,有人说阳性,也有人说阴性。这造成了日常工作中一定的混乱。每张切片中可有数目不等的阳性细胞.而其阳性强度也各不相同,因此一张切片中究竟有多少细胞阳性才算免疫组织化学最终结果的阳性,阳性强度又如何划分,是免疫组织化学结果判断的最为关键的问题。因为阳性标准不同,同一批实验所得出的完全可以是另一个诊断,另一个研究结果。

在判断标准上,还没有一个统一的标准或权威性的结论。目前主要有三种方法:(l)在判断中只考虑阳性细胞所占的百分比,按不同的百分比分级;(2)在判断中只考虑阳性细胞的染色强度,按不同的染色强度分级;(3)在判断上兼顾阳性染色的强度及数量。

在只考虑阳性细胞所占百分比的判断标准中,究竟多少细胞阳性才算最终结果的阳性分歧很大。有些人主张只要有一个细胞阳性,就算最终结果阳性。他们认为在肿瘤的诊断中,只要有一个细胞阳性就说明此肿瘤细胞有向该方向分化的潜能。如有的恶性黑色素瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、卵巢转移性癌等可由于大部分细胞分化很差,所以呈阳性的只是少数甚至个别的细胞,但这个别细胞恰恰反应了肿瘤的组织来源。而在癌基因的研究中某些癌基因蛋白的表达只要较少量就可影响患者的预后。鉴于上述两个原因,所以有相当一部分学者采用看到阳性细胞就算最终结果阳性这个标准。另外,也有很多学者分别以1%、5%、10%、20%、25%和50%等作为临界点来判断阳性。

也有许多学者在判断免疫组织化学结果时仅以染色强度为标准,往往是根据阳性染色的有无及强度来判断。通常可分为:(-)即无阳性染色;(士)即可疑阳性,(+)即弱阳性,(++)即中等阳性,(+++)即强阳性等。

在兼顾阳性染色的强度及数量的判断标准中,也有各种方法。第四军医大学赵彤等采用着色强度积分与数量积分相加的方法。他们将阳性细胞百分比分成5级。无阳性细胞为0分,阳性细胞≤25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。着色强度无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。着色强度积分与数量积分相加:0分为(-),2-3分为(士),4-5分为(+),6-7分为(++),其中(+)和(++)判为阳性。也有作者将数量和强度组合起来判断。数量上阳性细胞占20%-70%为1,>70%为2;强度上弱阳性为a,强阳性为b,两者的组合1a为弱阳性,1b或2a为中等程度阳性,2b为强阳性。Rem-mele和Stegner提出的免疫反应积分(IRS)打分法采用的是染色强度(Sl)和阳性细胞百分比(PP)的乘积,即IRS=51又PP。51可分为4级,即。级为未见阳性细胞即阴性,1级弱阳性,2级中等阳性,3级强阳性。PP可分为5级,即0级为阴性,1级簇10%,2级11%-50%;3级51%~80环,4级>80%。当SI与PP的乘积>3分时才算免疫反应(+)。

二、几个需要注意的问题

从上述情况可以看出,免疫组织化学结果的判断标准有待于进一步统一。当然在判断结果上,除了判断标准,还有其他一些需要注意的问题。下面谈谈我们的看法。

1.阳性成分的判断:通常所指的阳性,是指所需研究的细胞阳性。在肿瘤中就是指肿瘤细胞的阳性。其他间质细胞、炎症细胞等不应计入。在判断中,出血坏死区、受挤压的组织及切片边缘不应计入。

2.阳性细胞的定位:应当清晰而准确。如应是细胞核阳性的,仅在细胞质或膜上出现阳性的细胞不应算做阳性。

3.观察视野的大小:应先用低倍镜,后用高倍镜,且不少于5个高倍视野或1000个细胞。有些低倍镜观察到的细胞并非真正阳性。通过高倍镜仔细观察,可以剔除一些定位不准确的阳性细胞及一些并非所需研究的细胞的阳性。

从上述情况可以看出,免疫组织化学结果的判断标准有待于进一步统一。当然在判断结果上,除了判断标准,还有其他一些需要注意的问题。下面谈谈我们的看法。

4.与背景的对比:并非细胞内出现棕褐色即为阳性。很重要的一点在于细胞和周围背景的对比。纤维结缔组织在显色时通常相当容易着色,表现为一片棕黄(尤其在运用多克隆抗体时,背景往往较深)。此时只有当细胞的棕黄色程度明显高出背景者才为阳性。在操作过程中,也可运用一定的方法来降低背景着色,如染色前用蛋白酶消化、H2O2:和正常血清保护等。近年来的亲和素一生物素标记链霉菌素(LSAB)一微波免疫组织化学染色法,比用蛋白酶消化切片阳庄率和阳性强度均有提高,且更不容易引起非特异染色,背景更加清晰。这是一个值得推广的好方法。

三、阳性的判断标准

在癌基因和抑癌基因的判断标准上,曾有人建议将免疫组织化学和分子生物学方法的结果加以比较来设定标准。这有一定的参考价值。有文献报道,若p53的免疫组织化学标准定的太低,则DNA测序不应有阳性结果。但这个方法也有很大的局限性。因为免疫组织化学和分子生物学方法各有其特点,它们的结果并不完全一致。Sgorgen等比较了p53。DNA测序和免疫组织化学的结果,发现用免疫组织化学方法判断p53突变约有33%的假阴性和30%的假阳性。Elledge认为p53免疫组织化学染色阳性不一定是p53突变的结果,如正常细胞周期波动、对DNA损伤的反应、与其它细胞内蛋白的结合、P53负反馈调控机制的障碍均可导致p53蛋白检测阳性。分子生物学测得p53突变,免疫组织化学不一定表现为阳性,因为在伴有框架改变或编码序列无义突变时,p53蛋白缺少、缩短或不稳定,免疫组织化学方法反而检测不到p53蛋白。但在某些启动子区域或特殊区域发生的p53突变,DNA测序可检测不出,而免疫组织化学却表现为阳性。我们认为,无论是那些用于诊断和鉴别诊断的指标,还是癌基因、抑癌基因蛋白、受体或细胞增殖指标,都应有一个统一的判断标准。这样对病理诊断才有价值,日常的研究工作才真正得以统一。

我们认为阳性细胞应首先符合下列标准:(1)切片染色对比度好,背景清晰;(2)阳性细胞定位要准确;(3)出血、坏死、受挤压的组织及切片边缘不应作为判断的依据。在符合这3个基本条件的前提下,我们建议采用下面的判断标准。首先将染色强度打分:0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。(染色深浅需与背景着色相对比)。再将阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性,1分为阳性细胞簇≤10%,2分为11%-50%,3分为51%-75%,4分为>75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分才算免疫反应(+)。这个方法兼顾到阳性染色的强度和数量,且阳性的最低标准需>3分,对免疫组织化学的基本质量提出了一定要求,更为准确和客观。