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细胞增殖检测：3H同位素渗入法实例

点击次数：  更新时间：2017/4/10 14:13:14  

一、原理

 

淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

 

二、仪器和材料

 

RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、3H-TdR、闪烁液[2，5-二苯基恶唑（PPO）0.5g、1，4-双-（5-苯基恶唑基）-苯

 

（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混匀] 200目筛网，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。

 

三、实验步骤

 

1、脾细胞悬液制备

 

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色

 

计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。

 

2、淋巴细胞增殖反应

 

将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA 作为对照。置5% CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使其终浓度为

 

（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。

 

3、数据处理及结果判定

 

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对

 

非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

 

以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示

 

                              实验孔cpm

                   SI=  ─────────

                              对照孔cpm

 

受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。