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病毒培养实验——组织培养法--原代细胞单层培养

点击次数：  更新时间：2017/4/29 15:00:43  

   关于病毒培养实验，由于病毒必须在易感的活细胞内才能增殖，因此，根据不同病毒选择敏感动物，离体组织细胞和鸡胚进行分离培养。

   实验方法原理：

   组织培养是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，它的优点是：

   经济适用，结果正确且敏感

   较实验动物易于控制

   原代细胞单层培养法，是指动物（包括脊椎动物和无脊椎动物）的组织自机体取出后，经胰酶或其他细胞分散剂消化处理，得到单个细胞悬液。以一定量接种到特定容器中，加入细胞生长所必需的营养液，置合适温度中经一段时间的培养，分散的单个细胞即贴附玻壁，开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。

   实验步骤：

   1.  原代细胞单层培养

   原代细胞单层培养法，是指动物（包括脊椎动物和无脊椎动物）的组织自机体取出后，经胰酶或其他细胞分散剂消化处理，得到单个细胞悬液。以一定量接种到特定容器中，加入细胞生长所必需的营养液，置合适温度中经一段时间的培养，分散的单个细胞即贴附玻壁，开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。

   （1）取鸡胚：用碘酒棉球消毒气室端卵壳，再以酒精棉球消毒，然后以无菌镊子打开气室端卵壳，除去壳膜，换一把小镊子取出鸡胚胎，置于平皿中。

   （2）剪碎，洗涤：先除去鸡胚的头，爪，内脏，用Hank's 液洗一次，然后用小剪刀将鸡胚剪成1～2 毫米大小的碎块，加入Hank's 液约10 毫升，冲洗组织块，静置1～2 分钟，用毛细吸管吸去液体，同上法再洗涤二次，将血细胞充分洗去。

   （3）消化：将已洗净的组织置于三角烧瓶内，加入0.25% 胰酶溶液10～15 毫升，37 ℃水浴30 分钟，于消化期间应振荡2～3 次。由于胰酶的作用使大量细胞游离，液体变混浊。

   （4）分散细胞：取出消化瓶，以吸管反复冲打组织块，直至肉眼看不见组织块，全部成为分散细胞为止。将细胞悬液用四层纱布过滤，滤液经1000 转/分离心5 分钟后，吸去上清液，加入营养液5 毫升，制成均匀分散的细胞悬液。

   （5）细胞计数：取出0.1 毫升细胞悬液加于小试管中，加入0.9 ml Hank's 液稀释，混匀后，吸出少量悬液滴入血球计算板，用低倍镜计数，并按下列公式计算出每毫升细胞数。

   每毫升细胞数=（4大格细胞总数/4）× 104 ×稀释倍数

   

  （6）细胞分装及培养：按计算所得的细胞数，用培养液将细胞稀释成100 万细胞/ ml，接种40 孔聚苯乙烯微量培养板或细胞培养管，40 孔每孔0.l ml（含10 万细胞），加盖盖好，静置平放于CO2 培养箱中培养，细胞管每管分装0.7 ml（含70 万细胞），用胶塞塞紧，静置斜放使与平面成5°角，置37 ℃温箱中培养24～48 小时。此时在低倍镜下可见生长成单层的鸡胚成纤维细胞。

    2.  病毒接种及病毒对细胞致病变作用（CPE）的观察

    在低倍镜下，选择生成致密成单层的细胞培养管或40 孔细胞培养板，吸去培养液；培养管每管0.1 ml（细胞培养板每孔加入0.025 ml）的新城鸡瘟病毒液，分别置37 ℃温箱或CO2培养箱中使病毒吸附30 分钟，然后吸除病毒接种物，加入维持液，每管0.7 ml 或每孔0.2 ml，（含1% 小牛血清的0.5% 水解乳蛋白Hank\s 液，其他成分同营养液）置37 ℃培养。每天取出，低倍镜下观察有无细胞病变出现（细胞变圆，堆积及脱落）。注意要与不接种病毒的细胞对照作比较。

    注意事项：鸡胚单层细胞培养整个过程要求严格无菌。